気象庁によると4月16日未明の1時25分、熊本県南阿蘇村などで最大震度6強の地震が発生した。地震の規模を表すマグニチュードは、4月14日夜の地震より大きい7.3と推定される。同庁は今回の地震が「本震」で、4月14日夜の地震は「前震」だったという見方を示した。
その後も震度5弱や6弱の地震が続いており、九州地方の鉄道路線では、既に運転を再開していた路線も含め、運転の見合わせが拡大している。
国土交通省が4月16日8時30分までにまとめた情報によると、11社局の31路線で運転を休止。一時はJR四国の予讃線も運転を見合わせた。施設や車両の被害は4月14日の地震によるものも含め、土砂崩れによる線路内への土砂流入など大きな被害が確認されている。
九州新幹線では4月14日の地震による回送列車の脱線のほか、新玉名～熊本間で防音壁の落下や固定ボルトの浮き上がり、熊本駅で防風スクリーンや可動式ホーム柵などの損傷、熊本～新八代間でスラブ軌道の損傷、締結ボルトの破損、防音壁のずれ、熊本総合車両所構内で路盤の損傷が確認されている。
鹿児島本線では、小川～有佐間の軌道が沈下。豊肥本線では、赤水～立野間で土砂崩れが発生し、線路内に土砂が流入した。この土砂崩れでは、豊肥本線のほか国道57号と阿蘇大橋も巻き込んでいる。赤水駅構内では回送列車が脱線した。熊本～平成間では軌道の沈下が確認されている。熊本電気鉄道では北熊本駅のホームが一部損壊した。
4月16日15時までにまとめた運休線区は以下の通り。これ以外の線区でも列車の大幅な減便や遅れが発生している。
●JR九州
九州新幹線 ※全線
鹿児島本線 二日市～熊本～八代
豊肥本線 ※全線
肥薩線 八代～吉松
三角線 ※全線
筑豊本線 若松～折尾
筑豊本線 桂川～原田
唐津線 ※全線
佐世保線 肥前山口～早岐
久大本線 ※全線
日豊本線 行橋～延岡
日田彦山線 添田～夜明
●熊本市交通局（熊本市電）
※全線
●熊本電気鉄道
※全線
●肥薩おれんじ鉄道
肥薩おれんじ鉄道線 八代～肥後高田
●南阿蘇鉄道
高森線 ※全線
●くま川鉄道
湯前線 ※全線
